人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中26RFa的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明26RFa在骨形成、痛觉、内分泌、心血管以及能量代谢等方面都有重要的调节作用。
目的：观察26RFa在成骨培养体系中对人骨髓间充质干细胞增殖分化的影响。
方法：通过MTT实验，以此确定26RFa对人骨髓间充质干细胞是否有促增殖作用及其起作用的最大活性浓度；将人骨髓间充质干细胞接种于6孔培养板上，实验分为2组：实验组含有10-11mol/L的26RFa，对照组不含26RFa。取成骨诱导8，12，16 d细胞用碱性磷酸酶试剂盒测定细胞内碱性磷酸酶活性；成骨诱导21，28 d后行茜素红染色和Von Kossa染色，计算每张玻片钙化结节数，Western blot检测cbfa1的表达。
结果与结论：成骨诱导8，12，16 d后细胞内碱性磷酸酶活性实验组高于对照组(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.05)；21，28 d后茜素红染色和Von Kossa矿化结节数实验组均高于对照组；实验组细胞cbfa1表达明显高于对照组(P < 0.05)。说明在适宜的培养条件下，26RFa可促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 人骨髓间充质干细胞, 26RFa, 分化, 成骨细胞, 碱性磷酸酶, cbfa1

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that 26RFa plays an important regulatory role in bone formation, pain, endocrine, cardiovascular disease and energy metabolism.
OBJECTIVE: To observe the effects of 26RFa on the proliferation and differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: In order to obtain the most efficient concentration of 26RFa, human bone marrow mesenchymal stem cells were detected by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide analysis. Cells were inoculated into 6-well plates and then divided into two groups: experimental group treated with
10-11 mol/L 26RFa and control group with no 26RFa. After 8, 12 and 16 days of osteogenic induction, alkaline phosphatase activities in induced cells were detected using alkaline phosphatase kit. After 21 and 28 days of osteogenic induction, alizarin red staining and Von Kossa staining were performed. The number of calcified nodules over each coverslip was calculated, and the expression of cbfa1 protein was detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: After 8, 12, and 16 days of osteogenic induction, the alkaline phosphatase activities were higher in the experimental group than the control group (P < 0.05, P < 0.01, P < 0.05). After 21 and 28 days of osteogenic induction, alizarin red staining and Von Kossa staining showed that the number of calcified nodules was higher in the experimental group than the control group, and the expression of cbfa1 protein was also higher in the experimental group (P < 0.05). These findings indicate that 26RFa can promote the osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells under appropriate culture conditions.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, osteoblasts, alkaline phosphatase

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

2.1 人骨髓间充质干细胞形态学观察结果 人骨髓间充质干细胞分布均匀，形态均一，边界清晰，排列有序，呈纺锤形或梭形贴壁生长，外观呈旋涡状(图1A)。

2.2 MTT法测26RFa的最大活性浓度 比较不同浓度的26RFa对应的A值可以看出，26RFa浓度为10^-¹¹ mol/L、10^-¹⁰ mol/L两组分别与对照组相比，差异有显著性意义 (P < 0.01，P < 0.05，图1B)。从图1B可以看出，当26RFa 浓度小于10^-¹¹ mol/L时，其对人骨髓间充质干细胞的增殖作用随浓度的增大而增大，而26RFa浓度大于10^-¹¹ mol/L时，其对人骨髓间充质干细胞的增殖作用随浓度的增大而减小，因此26RFa的最大活性浓度为10^-¹¹ mol/L(P < 0.01)。

2.3 人骨髓间充质干细胞成骨诱导茜素红染色后矿化结节比较 成骨诱导21 d后行茜素红染色，可见对照组显色较少(图2A)，实验组显色较多(图2B)，每张玻片上的红染矿化结节数量实验组均高于对照组(69±8，45±6，P < 0.05)。

2.4 人骨髓间充质干细胞成骨诱导Von Kossa染色矿化结节比较 成骨诱导28 d后行Von Kossa染色，可见对照组矿化结节较少(图2C)，实验组矿化结节较多(图2D)，每张玻片上的矿化结节数量实验组均高于实验组(175.3± 13.5，114.3±12.0，P < 0.05)。

2.5 人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性测定 经成骨诱导8，12，16 d后实验组碱性磷酸酶的活性均高于对照组，各组均数比较，差异有显著性意义(P < 0.05；P < 0.01； P < 0.05，图3A)。

2.6 人骨髓间充质干细胞cbfa1表达的变化 与对照组人骨髓间充质干细胞相比，实验组细胞cbfa1表达量明显增加(P < 0.05，图3B)。

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引言

骨髓间充质干细胞是来自于中胚层的干细胞，主要存在于结缔组织及器官间质中，目前可以从骨髓、肝脏、胰腺、脂肪组织等组织器官中提取，胎儿脐血中亦可分离获得^[1] ，且现在研究表明在骨髓中含量最为丰富^[2-3] ，所以统成为骨髓间充质干细胞。其已经可以从多个物种中分离出来，比如兔、小鼠、大鼠和人^[4-5] 。
目前发现骨髓间充质干细胞有以下生物学特性：①增殖能力和多向分化能力：在体外特定的诱导条件下，骨髓间充质干细胞具有向成骨细胞、脂肪细胞、胰腺细胞、神经细胞、肌细胞、软骨细胞、肠黏膜细胞等方向分化的能力^[6-8] 。②免疫调节作用，通过细胞之间的相互作用产生特异性细胞因子进而抑制T细胞的增殖及免疫反应，最终发挥免疫调节作用^[9-11] 。③骨髓间充质干细胞来源方便，提取、纯化、培养及扩增均比较容易，研究表明其多次传代扩增后仍然具有干细胞的特性，并且移植到体内后无免疫排斥的特性。正是由于间充质干细胞具有以上生物学特性，目前已成为骨组织工程研究、血液系统研究、心脏疾病研究等的理想种子来源^[12-13] 。
以往的研究表明动物体内存在一类C端都以RF-NH₂结尾的内源性神经肽，这类肽被归为一个神经肽家族，并被命名为RF-NH₂相关肽，他们作为神经调质或者神经递质而广泛分布无脊椎动物和其体内。1977年，科学家在无脊椎动物体内提取出心脏兴奋活性的神经肽FNRF-NH₂^[14] 。2000年在哺乳动物体内发现了4种基因编码的RF酰胺结尾的肽的前体，分别是：神经肽FF(NPFF)、促乳腺素释放肽(PrPP)、metastin、RFRP^[15-19] 。
近些年，科学家在脊椎动物体内分离并鉴定出一类新的RF-NH₂相关肽：26RFa[20]，其结构和与其他的RF-NH₂无相关性，因此说明26RFa为RF-NH₂家族的一个新的分支^[21-23] 。在脊椎动物中，26RFa的氨基酸序列位于前体蛋白的C末端^[24] ；在哺乳动物，26RFa前体蛋白加工过程中于43RFa序列的精氨酸残基处或者26RFa序列的赖氨酸残基处发生断裂，所以就形成了43RFa和26RFa^[25-28] 。
26RFa(TSGPLGNLAEELNGYSRKKGGFSFRF-NH₂)是GPR103受体的内源性配体^[29-30] ，它主要分布于各种动物的脑组织中，尤其在下丘脑呈高水平表达^[24] 。26RFa的受体GPR103主要分布于物种的脑区^[31-32] 。有研究表明，26RFa在骨形成、痛觉、摄食、内分泌、心血管以及能量代谢等方面都有重要的调节作用^[33] 。尤其在调节骨生成方面，研究发现GPR103基因缺陷可以小鼠引起骨质疏松，在雌性小鼠还表现出脊柱后突、小梁变厚、成骨细胞减少，以上均表明软骨生成提前结束。因此，GPR103/26RFa可以调节骨生成，至少一部分通过软骨生长调节^[34] 。
骨髓间充质干细胞是一种具有多项分化潜能的祖细胞，在不同的条件下，可以转化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、心肌细胞等^[35-37] 。有效刺激骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的这一特性在骨组织工程和治疗骨质疏松方面均有着非常重要的临床意义。
实验观察26RFa在特定培养体系中对人骨髓间充质干细胞增殖分化的影响，为阐明26RFa促进骨生成的机制提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2012年12月至2013年6月在甘肃中医学院中心实验室完成。

材料：

实验方法：

细胞培养及实验分组：人骨髓间充质干细胞用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12在37 ℃孵箱(体积分数5%CO₂、饱和湿度)培养，间隔两三天换液，待细胞长至汇合瓶底80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

MTT法检测26RFa的最大活性浓度：细胞培养7 d，用2.5 g/L胰酶消化成单细胞悬液，细胞计数后将细胞悬液浓度稀释为2×10⁷ L^-¹，接种于96孔板中，每孔加200 μL，接种6×8孔，培养液为含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12，体积分数5%CO₂、饱和湿度、37 ℃孵箱培养箱中培养，46 h后吸出培养基，每孔加入无血清的DMEM/F12 200 μL，置于37 ℃孵箱培养箱2 h。吸出培养基，分别加入含有体积分数0.2%牛血清白蛋白(BSA)及浓度为0，1×10^-¹³，1×10^-¹²，1×10^-¹¹，1×10^-¹⁰，1×10^-⁹，1×10^-⁸，1×10^-⁷ mol/L的26RFa的无血清DMEM/F12培养基200 μL/孔，每组浓度设6孔细胞(对照组26RFa浓度为0)，继续培养48 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，置于37 ℃孵箱培养箱4 h，吸出上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，置于摇床上低速震荡10 min，酶标仪读取 570 nm处吸光度值(A值)，以时间为横轴，吸光度值为纵轴，绘制曲线。

成骨诱导：将人骨髓间充质干细胞以3×10⁴/孔接种于6孔培养板上，共接种5板(其中2板预置盖玻片，分别用于茜素红染色和Von Kossa染色)，每板细胞均分为对照组和实验组，每组共设3孔。通过MTT实验确定26RFa对人骨髓间充质干细胞起作用的最大活性浓度为1×10^-¹¹ mol/L，故以此浓度进行试验。实验组培养液含1×10^-¹¹ mol/L的26RFa，对照组培养液不含26RFa。

茜素红染色：取成骨诱导21 d的预置盖玻片的1板细胞，吸出培养基，加入适量PBS后摇床低速振荡5 min(重复2遍)，40 g/L多聚甲醛固定15 min，加入适量PBS后摇床低速振荡3 min(重复3遍)，加入适量0.1%茜素红后37 ℃水浴锅恒温孵育30 min，取出玻片，干燥后用中性树脂封固，镜下观察照相计数。

Von Kossa染色：取成骨诱导28 d的预置盖玻片的1板细胞，吸出培养基，加适量PBS后摇床低速振荡5 min，体积分数95%无水乙醇4 ℃冰箱固定15 min，加入适量PBS后摇床低速振荡5 min(重复3遍)，适量孵育液37 ℃水浴锅恒温孵育4 h，加适量PBS于摇床低速振荡3 min(重复2遍)， 2%硝酸钴适量室温静置5 min，适量PBS摇床低速振荡 3 min(重复3遍)， 1%硫化铵适量室温静置2 min，适量PBS低速振荡2 min，取出玻片，干燥后中性树脂封固，镜下观察照相计数。

碱性磷酸酶活性测定：分别于成骨诱导第8，12，16天各取出1板细胞，进行碱性磷酸酶活性测定，具体步骤按照人碱性磷酸酶ELISA检测试剂盒说明书的操作步骤进行，即收集样本：取细胞上清液，3 000 r/min离心10 min去除颗粒和聚合物，从试剂盒中取出所需板条，每孔加入待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL，每孔再加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅孵育60 min。弃去液体吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此反复洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μL，15 min内在450 nm波长处测定各孔的A值。

Western blot检测cbfa1蛋白的表达：细胞培养7 d后终止，两组细胞中分别加入蛋白裂解缓冲液，提取总蛋白、BCA法定量，以35 μL/孔上样，以10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，洗膜，加兔抗cbfa1(1∶400)多克隆抗体，4 ℃孵育箱过夜；加辣根酶标记的羊抗兔 IgG(1∶2 000)室温孵育2 h；ECL化学发光法显色，凝胶成像系统采集图像，软件Quantity One 4.31分析处理图像，β-actin作为内参行蛋白半定量分析。

主要观察指标：①人骨髓间充质干细胞形态学观察。②MTT法测26RFa的最大活性浓度。③实验组和对照组人骨髓间充质干细胞成骨诱导茜素红染色后矿化结节比较。④人骨髓间充质干细胞成骨诱导Von Kossa染色矿化结节比较。⑤人骨髓间充质干细胞内碱性磷酸酶活性及cbfa1表达。

统计学分析：应用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，数据采用x(_)±s表示，MTT实验所得数据、矿化结节计数所得数据采用单因素方差分析，碱性磷酸酶定量数据采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

1977年，有研究人员在哺乳动物的中枢神经系统中发现了四肽FMRF-NH₂^[38] ，之后将其归为RFa肽家族。随着近年来深一步的研究，RFa肽在机体内的重要作用不断的被发现，越来越引起医学、药学、生物学、化学等领域研究人员的广泛专注。
就目前的研究发现，RFa 肽在运动、肌肉收缩、摄食、心血管活性、神经内分泌、痛觉调节等方面都有着重要的调节作用^[39] 。2001年，Lee等的研究发现了一类与NPY2受体具有一定同源性结构的受体——GPRl03。随后又在脊椎动物体内鉴定出GPRl03的内源性配体26RFa(又称P518)及其N末端延长结构43RFa^[40] 。作为哺乳动物RFa肽家族的新成员，26RFa可能在维持生物的骨密度中起着重要的作用，有研究发现它可能会通过激活成骨细胞中受体来促进骨的生成^[41] 。
实验通过设立成骨诱导体系，旨在研究26RFa在成骨培养基中对人骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向增殖分化的影响。从MTT活性实验的数据可以看出，当26RFa浓度小于10-11 mol/L时，其活性随浓度的增大而增大；当26RFa 浓度大于10-11 mol/L时，活性随浓度的增大而减小，因此可以确定26RFa的最大活性浓度为10-11 mol/L。在成骨诱导8，12，16 d后行细胞内碱性磷酸酶活性测定，其结果显示，含26RFa的实验组的碱性磷酸酶活性均高于对照组，有统计学意义。成骨诱导第21天后行茜素红染色，其结果显示，含26RFa的实验组显色的红染矿化结节多于对照组。成骨诱导第28天后行Von Kossa染色，其结果显示，含26RFa的实验组矿化结节多于对照组。Western Blotting结果提示：实验组细胞cbfa1表达明显高于对照组(P < 0.05)。
以上实验结果说明，在含有26RFa的成骨诱导液中，人骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的能力增强。尽管在近些年的研究中，对26RFa在摄食、内分泌系统等方面研究已经有了较为深入的研究[42-44]，但是关于26RFa促进骨髓间充质干细胞分化成成骨细胞分化方面的研究还没有涉及，关于其具体机制探讨也有待进一步的实验研究。当然，本研究还存在一些不足，如26RFa促进成骨细胞后的相关蛋白以及基因水平的表达，对此未作深入研究。